回收冬蟲夏草和蝠蛾昆蟲的人工培育技術(shù)
要進(jìn)行冬蟲夏草的人工培育，首先必須大量人工飼養(yǎng)寄主一一蝠蛾屬昆蟲。蝠蛾一生中有98%的時(shí)間都在土壤內(nèi)生活，僅有2.5一13d的成蟲期營地面生活。所以，這類昆蟲的人工飼養(yǎng)管理主要是在土壤中開展。
1.蝠蛾的飼養(yǎng)工具
(1)蝠蛾卵的飼養(yǎng)工具。飼養(yǎng)蝠蛾卵可用兩種方法，一是用直徑 15一20cm的玻璃培 養(yǎng)皿，墊上2一3層濾紙，皿內(nèi)放一塊吸水棉保持濕度，每皿可飼養(yǎng)200一500粒卵。此法利于觀察，但難掌握濕度。二是用l0cm xX5一8cm的廣口瓶或者25cm x 30cm的玻璃飼養(yǎng) 缸，內(nèi)置3一5cm厚的過篩細(xì)腐殖土，種上1一2棵珠芽寥植物，把卵放養(yǎng)于土表至lcm深的土層中，每瓶可飼養(yǎng)300一1000粒卵；飼養(yǎng)時(shí)只要掌握住植物不枯萎，即可不加濕度。此法卵的孵化率高，但觀察和移植幼蟲對比較困難。
(2)幼蟲的飼養(yǎng)工具有以下4種。
a.玻璃養(yǎng)蟲缸：用18一25cmX30一35cm的玻璃缸，也可用標(biāo)本浸泡缸，放置土壤15一25cm，種上幼蟲取食的植物，把剛孵化幼蟲移入缸內(nèi)，每缸可飼養(yǎng)10一30頭幼蟲。
b.地下養(yǎng)蟲箱：箱一般高30一50cm，寬20一25cm，厚3一5cm。飼養(yǎng)箱骨架用鋼筋 焊成，上面鋼筋做成提手，便于提動；寬的兩面用3一5mm玻璃，便于觀察蟲體活動；底 和兩個(gè)側(cè)面裝上16孔目的銅紗網(wǎng)，便于水分滲入。然后裝上土壤，種植飼料植物，每箱放養(yǎng)20 一50頭幼蟲；在較堅(jiān)實(shí)的地上挖一個(gè)比飼養(yǎng)箱體積稍大和深的槽，把養(yǎng)蟲箱放入槽中，觀察時(shí)將養(yǎng)蟲箱提出地面，抹去外表玻璃上的土壤，即可清楚看到幼蟲活動情況。
c.大型養(yǎng)蟲籠：在半自然的狀況下，選擇一塊排水好、土質(zhì)疏松的場地，挖長12一l5m、寬2一3m、深4Ocm的深槽，底部和四周墊上尼龍紗網(wǎng)(最好用雙層，小蟲不易鉆出)，再把疏松的腐殖土鏟進(jìn)填平，種上幼蟲食物，放入幼蟲飼養(yǎng)，每平方米可放養(yǎng)30一50頭；該法有利于大規(guī)模飼養(yǎng)，但觀察困難。
d.用各類盆具裸露飼養(yǎng)：把植物飼料洗凈放入盆中，放入幼蟲飼養(yǎng)，盆口覆蓋一層黑布或者黑紙遮光。此法利于生活史觀察，但要注意勤換飼料和清除糞便。
(3)蛹和成蟲的飼養(yǎng)工具。制作長50cm、寬50cm、高55一60cm的養(yǎng)蟲箱。底部用薄鐵板或雙層銅紗網(wǎng)封底；頂和四周用鐵紗或尼龍紗封蓋，前面可制成一道活動紗網(wǎng)門。在箱底放入10一20cm的土壤，種上植物，把蛹和成蟲放養(yǎng)土中，此法可進(jìn)行密植飼養(yǎng)。
2.飼養(yǎng)技術(shù)要點(diǎn)
(1)土壤的選擇。土壤是蝠蛾昆蟲一生中最主要的活動場所。土壤條件是否適合該蟲生活是人工飼養(yǎng)成活率高低的關(guān)鍵之一。最適宜蝠蛾生長的是高山草甸土；次之是流石灘和草甸混合土；再次之是高山棕色、暗棕色林土，其他土壤對此蟲生長不良。
(2)食料的選擇。幼蟲最喜取食圓穗蓼、珠芽蓼、黃芪、小大黃等植物的嫩根芽。由于蝠蛾昆蟲是一類雜食性昆蟲，在無上述植物的地方，可用禾本科 (如青稞、麥、谷芽等)；十字花科、莎草科的嫩根飼養(yǎng)。在中、低海拔地區(qū)(適宜生活的溫度下)用土大黃、胡蘿卜、白蘿卜、白薯 (紅苕)、馬鈴薯、蘋果等飼喂也能正常生長發(fā)育，最好為土大黃、胡蘿卜和白薯三類。
(3)溫、濕度的選擇。蝠蛾昆蟲是一類耐低溫而怕高溫的昆蟲。最適宜在15一19C中生活成長；此蟲最適宜空氣濕度75%一85%，土壤含水量40%一45%之間。
3.管理技術(shù)
(1)成蟲期。成蟲不取食任何食物，只要保持水分和適宜溫度即能正常成活和產(chǎn)卵。但蛾子棲息環(huán)境與產(chǎn)卵量有關(guān)。成蟲最喜選擇有杜鵑和蝠蛾幼蟲取食的蓼科等植物根旁產(chǎn)卵，所以在蛾子交配產(chǎn)卵前植上幾株相關(guān)植物最佳；另外不能有強(qiáng)光影響。
(2)卵期。要使卵能正常孵化，一定要掌握好適宜的溫、濕度。
(3)幼蟲期。幼蟲由于生長期長，而且蟲體壁薄而易破，飼養(yǎng)時(shí)一定要細(xì)心，除了必要的觀察、換土和換食料外，盡量減少翻動。幼蟲的飼養(yǎng)關(guān)鍵是初孵的幼齡時(shí)期，初孵幼齡蟲要給足細(xì)小鮮嫩、濕度不高的食物；土壤最好經(jīng)過篩檢，以免粗硬物擦傷主體。此外，為了延長食料和土壤不霉壞，更換前用紫外燈照射殺菌l5min，土壤也可在陽光下暴曬1一2h后再用。
(4)蛹期。養(yǎng)蛹時(shí)，把養(yǎng)蛹器皿內(nèi)的土壤壓實(shí)，然后用與蛹粗細(xì)的木棍人工造一土室，土室略斜，深約2一3cm，每室放一蛹，放蛹時(shí)，蛹頭向土表面，上用細(xì)土蓋住。蛹的溫濕度，可控制在大氣濕度80%一85%，土壤含水量42一45%之間，溫度18一22℃之間。
(二)冬蟲夏草菌的人工培養(yǎng)技術(shù)
要獲得純正的冬早夏草菌種必須進(jìn)行人工的分離、純化、復(fù)壯、保存等工作。
1.分離冬蟲夏草菌的技術(shù)與條件
(1)材料要求。獲得純的菌種對材料要求比較嚴(yán)格；一般來說如果是進(jìn)行冬蟲夏草的組織塊分離法，最佳的分離材料是每年的10月底至11月份，青藏高原高寒草甸土壤剛開始凍結(jié)時(shí)期采的材料，這個(gè)時(shí)期冬蟲夏草菌剛感染蝠蛾幼蟲進(jìn)入僵蟲期不長時(shí)間，嫩小的子座芽剛長出蟲頭部0.2一0.5cm，蟲體內(nèi)其他雜菌較少，最易進(jìn)行分離。如果是第二年5一6月份采的材料，僵蟲體和子座上都有許多種雜菌共生或腐生，難獲得純菌種。若用子囊孢子進(jìn)行分離培養(yǎng)，材料最好在每年的7月中、下旬子囊孢子剛有部分成熟期采集分離培養(yǎng)。
(2)操作方法。有以下3步。
a.僵蟲體 (即菌核)的分離：分離前，用水刷洗干凈主體表面，再用無菌水清洗2一3次；用0.1%一0.2%的升汞溶液，對分離材料進(jìn)行約3一5min的表面消毒；再用無菌水清洗。選取與胸足為界的前段部分。用解剖刀切去表皮，避開消化道，取血腔菌絲切成芝麻粒大小，壓入平板培養(yǎng)基中，每皿1一2粒。置于15一19℃中培養(yǎng)，待菌落長出0.2一0.5cm時(shí)，挑選少量菌絲反復(fù)在平板培養(yǎng)基上分純2一4 次，確定無其他雜菌后，移入試管保存和培養(yǎng)。
b.子座芽分離：從僵蟲頭頂切下洗凈的子座芽，置入0.1%升汞液中消毒2一3min，用無菌水洗凈，切取中間部位組織塊壓入培養(yǎng)基中；培養(yǎng)條件同a。
c.子囊孢子分離：用透明紙袋套住子囊孢子成熟的子座，讓子囊孢子彈跳粘貼在紙袋上，然后，把有子囊孢子的紙袋浸入25%的葡萄糖液中，洗下孢子，放入15一19℃中培養(yǎng)，每天鏡檢，當(dāng)袍子萌發(fā)時(shí)，用微吸管吸單個(gè)孢子滴于平板中培養(yǎng)；培養(yǎng)條件同a。也可把整個(gè)成熟的冬蟲夏草帶回室內(nèi)，用棉紙把僵蟲和連蟲體的子座包住，僅留出有孕部分，在無菌室中，橫放，下置一片載玻片，隨時(shí)保持主體濕度；每天鏡檢，當(dāng)看到子囊孢子彈到玻片時(shí)，用微吸管吸到平皿的培養(yǎng)基中培養(yǎng)；培養(yǎng)條件同a。
(3)培養(yǎng)基的選用。
a.馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基 (PDA)，此種配方是所有蟲草菌屬真菌的通用培養(yǎng)基，在分離培養(yǎng)初期可用該配方，不過菌種生長不十分旺盛，而且易老化、退化。
b.加富培養(yǎng)基 (1)：多性蛋白臍10g，葡萄糖50g，磷酸氫二鉀1g，硫酸鎂0.5g，活蠶蛹30g，生長素0.5μg，瓊脂20g，加水1000mL，pH： 5.0。
加富培養(yǎng)基 (Ⅱ)：蛋白脯40g，葡萄糖40g，去皮鮮馬鈴薯100g，磷酸氫二鉀1g，硫酸鎂0.5g，牛肉膏10g，生長素0.5μg，蝠蛾活幼蟲 (磨碎)30g，瓊脂20g，高寒草甸土浸出液10OOmL，pH：5.0。
在加富培養(yǎng)基上，菌落比在PDA培養(yǎng)基上生長旺盛和迅速；加富 Ⅱ號又優(yōu)于Ⅰ號。
2.生長特性 冬蟲夏草菌的分離培養(yǎng)中須掌握溫度、pH值、光照、碳和氮源及無機(jī)鹽的利用狀況。
(1)不同溫度對菌絲生長的影響。冬蟲夏草菌喜偏低溫度。在0 一4℃時(shí)能緩慢生長；5一8℃時(shí)生長速度加快；10一19℃是此菌較適生長發(fā)育的范圍;最佳生長溫度為15一l9℃。超過20℃菌絲猛長，菌落由白色變?yōu)榛液诨蜃攸S色，開始出現(xiàn)變異，所以不宜高溫培養(yǎng)。
(2)對pH值的要求。冬蟲夏草菌是一種偏酸性真菌，最適pH值為 5.0一6.0，當(dāng)pH值為4.5以下和6以上時(shí)，隨著增高或降低，生長緩慢至不生長。
(3)光照的影響。此菌的子囊孢子萌發(fā)和菌絲生長初期，適應(yīng)于弱光和短光照，后期則適應(yīng)于較強(qiáng)光照。在人工培養(yǎng)中，菌絲、分生孢子和子座等具有明顯的趨光性，向陽面生長多而密，背光面生長稀疏，全黑環(huán)境下培養(yǎng)的各種菌態(tài)纖弱、細(xì)長、稀疏。
(4)對碳源的利用。冬蟲夏草菌可利用多種碳源，但以葡萄糖和麥芽糖合用時(shí)生長最快，單用葡萄糖時(shí)也能良好地生長，次之是馬鈴薯等淀粉，再次之是蔗糖。
冬蟲夏草菌是一種由寄生活體寄主，再由腐生階段發(fā)育成熟的真菌，所以對氮源中的多種有機(jī)氮均能較好的利用。而以活蟲體最佳；蛋白胨與酵母膏合用生長也十分理想，次之是二者單獨(dú)使用，再次之是牛肉膏等。而對無機(jī)氮如硫酸銨、硝酸鉀等利用較差。 對灰分養(yǎng)料有一定的需求，在有微量的硫酸鎂、磷酸氫二鉀的培養(yǎng)基中生長旺盛，次之是磷酸二氫鉀，其他鈉、鈣、鐵、銅等無機(jī)鹽也可利用。
3.培養(yǎng)方式 冬蟲夏草菌分離純化后，即可作為各種實(shí)驗(yàn)和擴(kuò)大生產(chǎn)應(yīng)用。
(1)其擴(kuò)大生產(chǎn)的方法常有三種：固體靜置培養(yǎng)法、振蕩培養(yǎng)法和大罐通氣發(fā)酵培養(yǎng)法。
a.靜置培養(yǎng)：主要用在固體培養(yǎng)，如試管斜面、三角瓶培養(yǎng)、米飯培養(yǎng)等等。在靜置培養(yǎng)中只要掌握好溫度和光照即可使菌正常生長。當(dāng)斜面上的分生孢子成熟后，即可存入1一2℃的冰箱中保存8 一14個(gè)月，也可作為種子直接用于生產(chǎn)。
b.振蕩培養(yǎng)：采用液體培養(yǎng)菌種或小規(guī)模繁殖培養(yǎng)，都可用振蕩培養(yǎng)。振蕩培養(yǎng)的培養(yǎng)基，把固體培養(yǎng)基減去瓊脂即可。設(shè)備最好選用恒溫振蕩培養(yǎng)機(jī)，用三角瓶置液體培養(yǎng)基，把試管固體菌種接入即可培養(yǎng)。經(jīng)不斷振蕩使液體培養(yǎng)基中各種成分混合均勻而不致沉淀，同時(shí)促進(jìn)氣體與液體接觸和交換，使氧進(jìn)入液體培養(yǎng)基中，利于菌絲生長和分生孢子形成。
c.大罐通氣發(fā)酵培養(yǎng)：在大規(guī)模生產(chǎn)菌絲和分生孢子等菌粉時(shí)，必須用大罐通氣發(fā)酵培養(yǎng)法。該方法通氣是采用吸氣或真空泵減壓等方法，經(jīng)過濾器除雜菌，送入罐內(nèi)液體培 養(yǎng)基中供冬蟲夏草菌的生長發(fā)育。
(2)發(fā)酵工藝流程。自然冬蟲夏草分離純化→ 試管斜面種→ 振蕩器液體一級 種→ 二級種→ 小型種子發(fā)酵種子罐→ 生產(chǎn)發(fā)酵罐 → 濃縮→ 噴粉干燥→ 成品菌粉。
冬蟲夏草菌罐中發(fā)酵要求溫度在20一25℃，罐壓392.3一 686.5kPa(0.4一0.7kg/cmz)，通氣量為0.5一1.OVVm*；注入發(fā)酵罐中的液體培養(yǎng)基為罐容的65%一75%為宜。 接種量為10%，攪拌速度為180r/min，培養(yǎng)時(shí)間72一96h，即可放罐濃縮和噴粉。
(3)發(fā)酵培養(yǎng)基多用。鮮馬鈴薯 (去皮)8%，蔗糖2%，玉米淀粉 0.5%，蠶蛹粉1%，蛋白胨0.4%，硫酸銨0.2%，pH值5.5一6.0。
(4)發(fā)酵培養(yǎng)成品標(biāo)準(zhǔn)。分生孢子即幾全脫落母體孢子梗，孢子梗數(shù)量增加不明顯 時(shí)，在鏡下計(jì)數(shù)檢查，每毫升含分生孢子18億一 25億個(gè)；殘?zhí)堑陀?%；氨基氮低于0.2mg/mL，即可成為成品菌液。
4.冬蟲夏草菌回接要點(diǎn) 把有性型或無性型的冬蟲夏草菌孢子回接到寄主昆蟲體上，是人工培養(yǎng)有性型冬蟲夏草和復(fù)壯無性型菌種的關(guān)鍵措施。
(1)回接時(shí)期。冬蟲夏草回接關(guān)鍵在于選擇寄主昆蟲抗菌薄弱時(shí)期，一是蛻皮期；二是幼蟲取食活動激烈，摩擦損傷率較高時(shí)期。
(2)回接方法。又分兩種。
a.噴霧法：當(dāng)飼養(yǎng)的蝠蛾幼蟲達(dá)4一6齡蟲，有1/3以上的幼蟲蛻皮時(shí)，把幼蟲集中，用子囊孢子或者分生孢子對入5%一10%葡萄糖液噴霧到蟲體或食物上，接種后約30min，菌液在蟲體上略干，把幼蟲放回土壤中任其自然生活。此法感病率高，但缺點(diǎn)是，幼蟲不易從土中取出集中，而且集中時(shí)幼蟲有互相殘殺的習(xí)性，蟲體被咬傷后，易被雜菌感染致死，冬蟲夏草菌絲未充滿體腔時(shí)，傷蟲就會腐爛，不能形成僵蟲 (菌核)。
b.自然接觸法：在大面積半自然土壤中飼養(yǎng)蝠蛾幼蟲，定時(shí)取小樣觀察幼蟲生長狀況，當(dāng)大部分幼蟲適宜感病時(shí)，用飼料植物浸菌液種植和用細(xì)土拌菌接種，均勻撒入養(yǎng)蟲的地表上，然后噴水，使菌滲入土中，幼蟲取食活動時(shí)接觸感染。此法寄主感染率不太高，但一經(jīng)感染致病，冬蟲夏草菌長勢好，而且未感病的蝠蛾幼蟲能正常生長，繁殖后代。
